云南省教育厅科学研究基金(2010Y219)
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
- 相关作者：李颖霍金龙曾养志潘伟荣刘丽仙更多>>
- 相关机构：云南农业大学云南农业职业技术学院昆明医学院第二附属医院更多>>
- 发文基金：云南省应用基础研究计划面上项目云南省教育厅科学研究基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立
- 2011年
- 目的快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品。方法利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT-PCR扩增。纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线。结果建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达103和105拷贝,线性范围分别为103～109和105～109拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R2分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%。结论成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。
- 霍金龙李颖赵跃潘伟荣刘丽仙霍海龙曾养志
- 关键词：实时荧光定量TNF-Α基因基因表达
