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国家自然科学基金(30170893): 作品数：29 被引量：50H指数：4; 相关作者：高美华王秋波任书荣张艳丽张丽更多>>; 相关机构：青岛大学青岛市市立医院中国海洋大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金山东省自然科学基金山东省教育厅科技计划更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

藻蓝蛋白对Hela细胞CD59基因表达调控作用的研究被引量：7: 2006年; 探讨了钝顶螺旋藻藻蓝蛋白（PC）对Hela细胞CD59基因表达的调控作用。以正常人CD59cDNA基因为模板，经PCR扩增后重组入真核表达质粒载体pALTER-MAX，然后利用阳离子脂质体（Lipfectamine-2000）将重组质粒和PcDNA共转染人子宫颈癌细胞（Hela）和对照用正常中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO）进行表达。用不同浓度的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白作用于转染细胞，通过核酸分子杂交技术、免疫荧光标记法和ELISA法对细胞中CD59分子的表达进行检测。结果表明：成功构建了重组质粒pALTER-MAX．CD59，并将其导入真核细胞（Hela，CHO），经CAl8筛选获得了CD59分子高效表达的细胞克隆。用藻蓝蛋白作用于筛选出的转基因细胞，证实藻蓝蛋白可促进Hela细胞表面CD59蛋白的表达并抑制Hela细胞的增殖，而对于正常CHO细胞无明显作用。; 李冰张学成高美华褚现明; 关键词：藻蓝蛋白 CD59 HELA CHO

人CD59基因的突变和表达及其活性研究被引量：10: 2005年; 　目的: 构建人突变CD59(hmCD59)基因的真核表达系统, 深入研究hmCD59在糖尿病血管并发症中的作用。方法: 分别构建两种含有hmCD59全长cDNA序列的重组pALTER质粒, 运用脂质体介导法, 与pcDNA3质粒共转染CHO细胞, 以G418筛选阳性克隆(编号为hmCD59- 1- CHO及hmCD59 -2- CHO)。应用荧光抗体技术、免疫酶联技术及Westernblot, 进一步检测hmCD59蛋白在转染细胞膜表面的表达。通过双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯 (BCECF/AM)荧光染料释放试验, 对hmCD59蛋白糖基化前后的抗补体活性进行检测。结果: 筛选出的阳性克隆细胞用荧光抗体技术免疫酶联技术检测表明, 在细胞膜表面有hmCD59分子表达。将细胞的裂解物进行Westernblot证实, 在其相对分子质量(Mr)为 20 000处可见 1条与CD59的Mr相当的蛋白带。BCECF/AM荧光染料释放试验提示, 两种突变质粒的表达产物均具有抗补体活性, 糖基化后活性减弱。结论: 获得两株可稳定表达hmCD59的细胞。表达的hmCD59具有抗补体活性, 但糖基化后活性减弱。; 张艳丽高美华; 关键词：真核表达中国仓鼠卵巢细胞抗补体活性

人突变CD59基因在CHO细胞的表达、检测及生物活性研究被引量：3: 2007年; 目的:分别构建两个高效表达人突变CD59的CHO细胞真核表达系统,探讨突变CD59基因表达蛋白糖基化前后抗补体活性的变化,为在基因水平阐明糖尿病血管增殖症的发病机理奠定基础。方法:将两种含不同突变基因的人CD59全长cDNA序列(HM7、HM8)的重组pALTER质粒运用阳离子脂质体导入法共转染CHO细胞,用含有400μg/ml新霉素类似物(G418)的F12培养基筛选出阳性表达克隆,应用荧光免疫组化(FIH)检测CD59在CHO细胞表面的表达。经染料释放试验检测突变CD59糖基化前后抗补体活性。结果:运用阳离子脂质体导入法将重组pALTER质粒与pcDNA3质粒共转染CHO,成功筛选出的阳性克隆经FIH证明突变CD59可在CHO细胞表达。染料释放法证实两种突变CD59均具有抗补体活性,且在高糖环境下易糖基化,糖基化后抗补体活性明显降低。结论:建立了两个高效表达突变CD59的真核表达系统,获得阳性克隆细胞株。初步研究证实突变CD59具有抗补体活性,糖基化后抗补体活性明显降低,为单克隆抗体的制备奠定了基础。; 吴宁高美华; 关键词：真核表达系统 CHO细胞细胞转染抗补体活性

突变型CD59蛋白对卵巢癌细胞的抑瘤效应: 2009年; 背景与目的:国外报道已在多种实体肿瘤细胞中发现有CD59分子的过表达,并与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关。本研究探讨突变型CD59在卵巢癌细胞A2780表面的抗补体活性以及与LPS联合抑制A2780细胞增殖的活性。方法:取突变型CD59质粒、野生型CD59质粒分别转染A2780细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆,并从基因水平和蛋白水平鉴定CD59突变基因和野生型基因的转染情况。MTT法观察野生型CD59与突变型CD59在A2780细胞表面的抗补体活性,以及突变型CD59在LPS存在时对细胞的抑瘤效应。结果:通过荧光免疫检测、流式细胞术分析、RT-PCR鉴定证明建立了稳定转染野生型和突变型CD59的A2780细胞。MTT结果显示,与野生型CD59相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能,与对照组未转染的A2780细胞相比无显著性差异。MTT检测5μg/mLLPS作用30min,对转染野生型CD59、突变型CD59及未转染A2780细胞的增殖抑制率分别为(26.9±2.95)%、(36.3±4.87)%、(29.6±3.16)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭该位点能够提高补体溶细胞作用,并有助于LPS发挥抑制瘤细胞增殖活性,有望应用于肿瘤治疗。; 李健敏高美华张蓓; 关键词：CD59 补体 A2780细胞

来氟米特对小鼠CD4^+CD25^+调节性T细胞的影响被引量：3: 2008年; 目的:评价新型免疫抑制剂来氟米特应用对CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的影响。方法:以灌胃的方式给予正常BALB/c小鼠来氟米特或对照溶剂4周,流式细胞仪分析不同淋巴器官内T淋巴细胞亚群,包括CD4+CD25+调节性T细胞数量及比例的变化。结果:与对照溶剂组相比,LEF组小鼠脾、肠系膜淋巴结内CD4+T淋巴细胞和CD4+CD25+调节性T细胞比例均明显下降,外周淋巴结和胸腺没有明显变化;但胸腺内CD4+CD25+调节性T细胞/CD4单阳性胸腺细胞的比例明显增加。结论:来氟米特对中枢和周围淋巴器官内CD4+CD25+调节性T细胞的影响不同。胸腺内CD4+CD25+调节性T细胞对来氟米特的作用与CD4单阳性胸腺细胞相比具有较强的抗性;而脾及淋巴结的CD4+CD25+调节性T细胞对来氟米特的反应与非调节性T细胞相似。; 伊焕发甄昱张连军赵勇; 关键词：来氟米特调节性T细胞免疫抑制

CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响被引量：1: 2010年; 目的研究CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响。方法构建CD59配体肽基因的真核表达重组体(CD59配体-pIRES),转染人卵巢癌细胞A2780,G418筛选稳定表达细胞克隆;RT-PCR及Westernblot方法检测细胞表面CD59 mRNA及蛋白的表达;MTT法测定细胞增殖抑制率。结果成功构建了CD59配体肽基因真核表达重组体,转染后的A2780 CD59 mRNA及蛋白的表达水平与WT-A2780比较均明显下降(t=9.217、.20,P<0.05);细胞增殖抑制率明显增高(F=5.417,q=3.93,P<0.05)。结论CD59配体肽基因可影响人卵巢癌细胞A2780表面CD59的表达,有望用于肿瘤治疗。; 李伟伟高美华张蓓解西河; 关键词：A2780细胞重组融合蛋白质类

人突变CD59基因在卵巢癌细胞表达及其生物活性检测: 2009年; 目的研究野生型CD59与突变型CD59在卵巢癌细胞A2780表面的抗补体活性。方法取突变型CD59质粒、野生型CD59质粒分别转染A2780细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆;酶免疫法及RT-PCR方法检测细胞表面CD59蛋白及mRNA的表达;制备抗CD59多克隆抗体,MTT法观察CD59蛋白的抗补体活性。结果野生型及突变型CD59质粒扩增成功,并成功建立了稳定转染野生型和突变型CD59的A2780细胞株;与野生型CD59相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能,与未转染A2780表面CD59表达无显著差异。结论CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭该位点能够提高补体溶细胞作用,有望应用于肿瘤治疗。; 李健敏高美华张蓓; 关键词：卵巢肿瘤突变

CD59配体肽真核表达系统的构建及对PC-3细胞活性的作用研究被引量：1: 2010年; 目的:构建CD59分子配体肽sp22基因重组真核表达系统,探讨sp22基因对CD59分子的影响。方法:构建含特异性sp22基因的真核重组表达载体sp-pIRES,脂质体法转染人前列腺癌PC-3细胞,G418筛选建立稳定转染细胞系,RT-PCR检测转染细胞中sp22基因mRNA的表达筛选阳性细胞克隆,Western blot、ELISA竞争抑制试验检测转染细胞CD59蛋白的表达;台盼蓝染色实验和LDH实验测sp22基因对CD59分子功能的影响。结果:PCR、酶切及DNA测序鉴定表明成功构建了sp-PIRES重组表达载体;RT-PCR试验证实sp22在spPC-3细胞中成功表达;Westernblot、ELESA竞争抑制试验表明:spPC-3细胞比正常PC-3细胞CD59蛋白表达减少(P<0.05);与正常PC-3细胞相比,补体对spPC-3细胞的溶解杀伤明显增强(P<0.05)。结论:sp22基因可在mR-NA及蛋白水平影响人前列腺癌PC-3细胞表面CD59抗原的表达及功能,降低CD59分子抗补体活性,有望用于肿瘤治疗。; 李伟伟高美华张蓓解西河; 关键词：CD59 PC-3细胞补体

突变人CD59基因在真核细胞中的表达活性被引量：4: 2005年; 目的构建突变人CD59的真核表达系统,检测突变人CD59蛋白糖化前后抗补体活性,探讨CD59在糖尿病血管并发症病理机制中的重要作用,为人类糖尿病血管增殖症的发病机理提供依据。方法应用阳离子脂质体法将含有突变人CD59的重组pALTER质粒与pCDNA共转染入CHO细胞;G418筛选出阳性克隆,流式细胞术进一步筛选出高表达克隆;免疫组化、免疫荧光、Western-blot、ELISA验证CD59的表达;BCECF释放试验研究糖化前后突变人CD59抗补体活性。结果成功构建突变人CD59的真核细胞表达系统;糖化后较糖化前突变人CD59转染CHO细胞BCECF释放率明显升高。结论高糖使CD59活性下降,可能导致或加速糖尿病血管并发症的发生。; 张丽高美华; 关键词：CD59 中国仓鼠卵巢细胞补体

The Effect of Glycation of CD59 on Complement-Mediated Cytolysis被引量：3: 2005年; Vascular proliferation is one of the major causes for morbidity and mortality in diabetes. However, the cellular and molecular mechanisms that link hyperglycemia to this complication remain unclear. In present study, we demonstrated by site-directed mutagenesis that mutated CD59 was more susceptible to glycation-inactivation for hyperglycemia. Mutated and wild-type CD59s were stably expressed in Chinese hamster ovary cells using the pALTER-MAX mammalian expression vector. Western blot, FACS and immunological fluorescence were conducted to confirm that CD59s were tethered to the plasma membrane. Compared to wild-type CD59, human CD59 mutants led to a significant increase in dye release assay. These results indicate that there may be some mutations of CD59 in diabetes population and the mutated CD59, which is more likely to be of glycation than the wild-type, may help to explain the distinct propensity of diabetes subjects to develop vascular proliferation complications.; Ying Cheng Meihua Gao; 关键词：CD59

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