广东省自然科学基金(5002855)
- 作品数：16 被引量：40H指数：3
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- 小鼠sIL1ra基因克隆与其在骨髓抑制恢复中的功能研究
- 2008年
- 目的:构建鼠分泌型白细胞介素1受体拮抗剂(sIL1ra)基因的真核表达载体,进行体内表达,并研究其在5氟尿嘧啶(5-FU)所致骨髓抑制恢复中的作用。方法:根据鼠sIL1ra基因序列设计特异引物,以RT-PCR克隆其编码序列,并构建至phCMV真核表达载体中,通过胫前肌肌肉注射、随后电击转染等方法获得了该基因在小鼠体内的高效表达,并研究了sIL1ra的药效学功能。结果:体内表达sIL1ra能增加5-FU注射后小鼠外周血白细胞数以及骨髓细胞数(P<0.05或P<0.01)。结论:体内转染sIL1ra可以促进小鼠骨髓抑制后造血的恢复。
- 沈娟张巨峰邵红伟沈晗余雪松肖兰凤
- 关键词：基因克隆骨髓抑制
- 两株肿瘤细胞系HLA-I类分子基因表达水平的鉴定及意义
- 2007年
- 目的探讨两株常见肿瘤细胞系Hela细胞和BEL-7402细胞HLA-I类分子基因表达水平及其影响CTL反应性的可能意义。方法提取肿瘤细胞的基因组DNA,利用PCR反应在基因组水平鉴定HLA-I类分子基因的拷贝数情况;提取细胞总RNA,RT-PCR反应合成cDNA,利用PCR反应鉴定肿瘤细胞HLA-I类分子在RNA水平的表达情况。结果两株肿瘤细胞的HLA-I类基因在基因组水平的拷贝数无明显下降;在RNA水平上,Hela细胞的HLA-A、HLA-B和HLA-C基因均有表达,表达水平无明显下降,BEL-7402细胞的HLA-A和HLA-C基因有表达,但HLA-C基因表达水平降低,而HLA-B基因未见明显表达。结论RNA水平上,部分HLA-I类分子基因表达的降低或缺失推测可能是导致BEL-7402细胞比Hela细胞出现CTL反应性下降的原因之一。
- 关德莹沈晗邵红伟黄树林
- 关键词：HLA-I类分子HELA细胞BEL-7402细胞MRNA
- TCRVβ7.1基因修饰的T细胞对肝癌细胞体外杀伤及体内靶向识别作用的研究被引量：7
- 2007年
- 目的探讨TCRVβ7.1基因修饰的T细胞对肝癌细胞的体外杀伤活性及其在体内靶向识别肝癌细胞的作用。方法①体外实验:以特异性识别肝癌细胞的TCRVβ7.1基因转染健康人外周血单个核细胞(PBMC),转染前和转染后24、48h用流式细胞术检测转染基因的表达。将人肝癌BEL-7402细胞分为4组,其中3组分别与未经修饰的PBMC(PBMC组)、转染pcDNA3.1空质粒的PBMC(空质粒组)、转染TCRVβ7.1基因的PBMC(基因修饰组)共培养,1组作为阴性对照组。共培养前和共培养24、48h,以噻唑蓝(MTT)法检测PBMC对人肝癌BEL-7402细胞的杀伤活性。②体内实验:用重度联合免疫缺陷小鼠建立荷肝癌动物模型,于肿瘤周围皮下注射基因修饰的PBMC,于注射后2、7、14、28、42d各处死2只小鼠,分别取肿瘤、脾、肝、肺、肠、卵巢、心、脑、肾组织,检测基因修饰的PBMC在小鼠体内的存活时间及组织分布情况。结果①体外实验:流式细胞术检测表明TCRVβ7.1基因成功转染到T细胞并得到有效表达。MTT法检测显示,基因修饰组T细胞对肿瘤细胞的杀伤率(24、48h分别为31.24%±2.26%、40.95%±3.45%)明显高于PBMC组(分别为6.92%±3.12%、7.84%±2.29%)和空质粒组(分别为9.23%±2.46%、10.36%±3.34%),差异均有统计学意义(P<0.01)。②体内实验:肿瘤周围注射基因修饰的PBMC后2d,小鼠肿瘤组织已经出现PBMC(8个/视野),随时间延长PBMC数量呈上升趋势,28d达最大值(18个/视野)。取材于不同时间的小鼠组织标本的检测显示,基因修饰的PBMC只分布于肿瘤组织,而在其他组织中没有出现。结论TCRVβ7.1基因修饰可诱导T细胞活化并提高T细胞对肝癌细胞的杀伤活性;外源性TCRVβ7.1基因修饰T细胞在荷肝癌小鼠体内的分布具有肿瘤靶向性。
- 吕丽珊王金全邵红伟黄树林
- 关键词：转染肝肿瘤
- 淋巴细胞活性检测方法研究被引量：11
- 2008年
- 目的探讨淋巴细胞活性检测最佳方法,以提高检测灵敏度和稳定性,降低本底。方法用传统的实验方法和改进的实验方法分别对不同数量的外周血单核细胞进行检测,比较不同实验方法的准确性、灵敏度和稳定性。结果在不吸除培养基的情况下,传统的DMSO和酸性异丙醇都不能完全融解formazan,影响了检测。传统的酸性SDS能够很好的融解formazan,但是得到的OD值太小,这就降低了检测的灵敏度,容易造成测量误差。而改进的10%SDS溶液能够完全融解formazan,并且得到的OD值适中,能够客观的反应细胞数目的变化,减少数值引起的实验误差。结论用改进10%SDS作为溶解formazan的溶解液,可以准确地反应活细胞的数目变化情况,对淋巴细胞这类悬浮细胞来说,在不吸除上清的情况下进行细胞数目的检测更加方便。
- 薄华本邵红伟胡凌波黄树林
- 关键词：MTT比色法SDS细胞活性
- T细胞受体信号转导通路的动力学分析被引量：3
- 2008年
- 目的:建立T细胞受体信号转导途径的动力学模型,通过模型仿真揭示T细胞受体信号途径各分子间的动态调控过程,简要分析模型的动力学特性。方法:根据数据库KEGG及相关中英文文献,提取T细胞受体信号转导各条通路相关分子作用的方式及数量关系,利用Matlab7.0的Simulink工具箱构建信号途径的动力学模型并仿真。结果:模型仿真结果与文献符合得较好,能够从数量上反映T细胞受体信号转导途径中各分子间复杂的调控关系,并能通过模型仿真发现和验证该信号途径中的关键节点分子。结论:模型基本反映了T细胞受体信号转导途径的动力学特征,可以作为后续的精确定量关系研究的基础。
- 刘顺会肖兰凤黄树林
- 关键词：T细胞受体信号转导动力学模型
- 共表达TcRα12-2和TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建及其杀伤肝癌细胞作用的研究被引量：2
- 2008年
- 目的:构建共表达TCRα12-2和TCRVβ7.1重组腺病毒载体Ad.TCRα12.2-IRES-Vβ7.1,并研究其杀伤肝癌细胞的作用。方法:提取外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)总RNA,用RT-PCR的方法得到TCRα12-2基因。TCRVβ7.1基因由pCDN3.1-Vβ7.1扩增获得,将这两个基因以IRES相连克隆入腺病毒穿梭质粒pDC315中。穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装出可同时表达TCRα12-2和TCRVβ7.1的重组腺病毒。然后提取病毒基因组DNA,对外源目的基因进行PCR鉴定;病毒感染宫颈癌细胞(HELA),48小时后提取细胞总RNA,通过RT-PCR鉴定目的基因表达;最后病毒感染PBMC,用流式细胞仪检测目的蛋白的表达。对鉴定正确的病毒进行大量扩增并测定滴度。用MTT比色法检测Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染的PBMC对肝癌细胞HEPG2和BEL-7402的杀伤作用。结果:从重组病毒基因组中扩增出目的基因TCRα12-2和TCRVβ7.1,RT-PCR和流式细胞仪检测表明目的基因可以有效的表达。Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染PBMC组对肿瘤细胞的杀伤率明显高于PBMC组和Ad-GFP感染组。结论:成功构建了双表达TCRα12-2和TCRVβ7.1基因的重组腺病毒载体Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1,且其感染后的PBMC可有效的杀伤肝癌细胞。
- 王俊伟张巨峰张文峰牟艳芳邵红伟黄树林
- 关键词：TCR
- 小鼠促进骨髓抑制恢复相关因子IL-7基因的识别与克隆
- 2008年
- 目的寻找促进骨髓抑制恢复的相关细胞因子,进行骨髓抑制时基因表达差异分析,并对表达上调较大的细胞因子进行克隆验证。方法尾静脉注射5-Fu构建小鼠骨髓抑制模型,运用基因芯片方法分析正常小鼠与骨髓抑制模型第0,3,7,11,14天的基因表达差异,针对表达上调较大的鼠IL-7基因设计引物,以RT-PCR克隆其编码序列,并构建phCMV/IL-7真核表达载体。结果得到一组符合促进骨髓抑制恢复细胞因子特点的基因,其中细胞因子IL-7表达量升高30倍。结论IL-7符合促进骨髓抑制恢复细胞因子的特点,为研究骨髓抑制恢复的新方案奠定了基础。
- 沈娟胡耀华邵红伟肖兰凤
- 关键词：基因差异表达IL-7基因克隆骨髓抑制
- 补血方对环磷酰胺所致小鼠血虚模型的影响被引量：8
- 2009年
- 目的:观察补血方对环磷酰胺所致小鼠血虚模型的影响。方法:将小鼠分为空白对照组、补血方组、环磷酰胺组、环磷酰胺+补血方组(补血方低、中、高剂量)。给药后观察外周血常规、细胞周期。结果:补血方可改善因化疗药物环磷酰胺导致的小鼠血虚模型各项指标。结论:补血方对化疗药物环磷酰胺治疗具有良好的辅助作用。
- 王璐吴凤麟王金金薄华本黄树林
- 关键词：补血方环磷酰胺肿瘤化疗
- Hela细胞Survivin克隆及HLA-A2限制性CTL表位预测研究被引量：2
- 2007年
- 目的:从Hela细胞中克隆凋亡抑制因子Survivin的编码序列,进行测序,并由此预测其HLA-A*0201限制性CTL表位。方法:设计人Survivin基因序列特异引物,通过RT-PCR扩增Survivin编码序列,构建至pGEM-T载体后,测序分析,并对其进行了HLA-A*0201限制性CTL表位抗原表位相关预测。结果:从Hela细胞中克隆得到的Survivin和Survivin-ΔEx3两种剪接体,其中Survivin-ΔEx3发生1个同义突变和三个错义突变,预测其抗原表位抗原性发生了变化。结论:寻找抗原性强、结合力高的表位,对于今后抗肿瘤多肽疫苗的研究具有重要的意义。
- 孙裕昌沈娟沈晗邵红伟黄树林
- 关键词：SURVIVIN克隆CTL表位错义突变
- 人TCA-12-2/TCB-7.1真核双表达载体的构建与表达被引量：2
- 2008年
- 目的:将T细胞抗原受体基因TCA-12-2和TCB-7.1共同构建在真核表达载体pDC315,用于哺乳动物细胞293转染研究。方法:将分离得到的淋巴细胞总RNA反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增得到TCA-12-2基因;以实验室保存含TCB-7.1基因的质粒为模板,扩增得到TCB-7.1基因。随后酶切,连入载体pIRES2-AcGFP1,通过亚克隆连入载体pDC315,得到重组质粒pDC315-TCA-12-2-TCB-7.1。重组体质粒经酶切鉴定后,并对插入的TCA-12-2和TCB-7.1基因片段进行测序,将鉴定好的阳性重组质粒用脂质体介导转染293细胞,并通过RT-PCR和流式细胞仪检测TCA-12-2和TCB-7.1基因的表达情况。结果:TCA-12-2和TCB-7.1可以同时构建在载体pDC315上,RT-PCR和流式细胞仪检测发现TCA-12-2和TCB-7.1基因可以成功在293细胞上表达。结论:成功构建了含TCA-12-2和TCB-7.1基因的双表达载体。
- 张文峰张巨峰邵红伟王俊伟牟艳芳黄树林
- 关键词：受体抗原T细胞
