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利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用
本发明公开了一种利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用。其中的双价RNAi表达载体,命名为pRNAi‑TOCV‑TY。所述RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本...
金凤媚宋建薛俊孙海波
基于Gateway技术的人TGFBI高表达H2596胸膜间皮瘤细胞株的建立及鉴定
2020年
目的基于Gateway技术构建人转化生长因子诱导蛋白(human Transforming Growth Factor-induced protein,hTGFBI)高表达的人间皮瘤细胞株H2596,为后续间皮瘤增敏研究提供基础。方法商业购买hTGFBI全长基因原核细胞质粒,采用常规分子克隆技术及Gateway技术构建其慢病毒表达载体pDEST-hTGFBI并测序鉴定;pDEST-hTGFBI转染293T细胞进行慢病毒包装后感染人间皮瘤H2596细胞株;采用RT-qPCR和Western Blot分别从mRNA水平及蛋白质水平检测感染前后hTGFBI在H2596细胞株中的表达情况。结果测序结果证实成功构建慢病毒表达载体pDEST-hTGFBI;RT-qPCR及Western Blot结果提示转染后,H2596细胞株中hTGFBI mRNA及蛋白质平均表达水平分别为对照组的9.98和19.2倍,显著升高(P<0.05)。结论成功构建hTGFBI慢病毒表达载体pDEST-hTGFBI,并且hTGFBI在人间皮瘤H2596细胞株中呈高表达。
郑晋南张勤
关键词:间皮瘤GATEWAY技术
利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用
本发明公开了一种利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用。其中的双价RNAi表达载体,命名为pRNAi‑TOCV‑TY。所述RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本...
金凤媚宋建薛俊孙海波
Gateway技术构建菊芋块茎全长cDNA文库及EST测序分析被引量:3
2018年
为丰富菊芋功能基因组学研究基础平台,以成熟期菊芋块茎为材料,将菊芋全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了菊芋非剪切型全长cDNA文库。文库质量分析表明:未经扩增的原始文库库容量为5.76×10~6 CFU,插入片段大小主要为1~3000 bp,重组率为100%(24/24),达到了高质量文库的标准。利用该文库进行表达序列标签(expressed sequence tag, EST)测序,得到2639条高质量的EST序列,拼接后获得1895条非重复的唯一表达序列(unigene)。与NCBI的NR数据库同源比对分析表明,共有1533条unigene(80.9%)与已知基因有显著的同源性。GO分类结果显示:菊芋块茎表达基因在分子功能类群中,结合和催化活性所占比例最高。此cDNA文库将可用于菊芋功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及菊芋cDNA芯片的制备等。
杨少丽秦松
关键词:GATEWAY技术基因注释
花椰菜ERF114基因的克隆及Gateway技术构建表达载体被引量:4
2018年
【目的】为进一步探究花椰菜ERF114基因功能,从花椰菜中克隆ERF114基因并构建植物表达载体。【方法】利用RTPCR技术从花椰菜中分离ERF114基因;通过生物信息学软件对ERF114蛋白特性进行预测和分析;采用Gateway技术构建ERF114基因的植物表达载体。【结果】克隆获得了花椰菜ERF114基因,其全长为681 bp,编码226个氨基酸,具有1个AP2结构域。生物信息学分析显示,该蛋白质为亲水性蛋白,有1个跨膜区域,二级结构以α-螺旋,β-折叠和无规则卷曲结构为主。进化树分析表明,花椰菜ERF114与油菜的亲缘关系最近。同时成功构建了植物表达载体。【结论】成功克隆了花椰菜ERF114基因,对其进行生物信息学分析,并构建其表达载体,为探究花椰菜ERF114基因功能及分子调控机制奠定了基础。
韩占品任健于玮玮范夕玲李慧
关键词:花椰菜生物信息学
利用Gateway技术筛选Candidatus Liberibacter asiaticus致病相关基因研究被引量:1
2017年
柑橘黄龙病是危害全球柑橘产业健康发展的最严重病害之一,病原为韧皮部限制性细菌,我国的柑橘黄龙病由亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CaLas)引起。由于该病原菌难以获得离体纯培养,从而限制了其致病分子机制的研究。本试验根据已经报道的植物病原细菌致病相关基因特点,从黄龙病菌亚洲种Psy62菌株全基因组序列(Psy62:NC_012985.1)中选取3个假定致病相关基因,分别标记为PalCa _(Las)、MotCa _(Las)和HlyCa _(Las),利用Gateway技术的同源重组原理,将3个基因通过BP反应和LR反应,分别构建到植物表达载体psk103中,接种本生烟(Nicotiana benthamiana)后,通过瞬时表达筛选可诱导_(N.)benthamiana产生过敏性坏死反应的功能基因。经过PCR克隆和测序验证,PalCa _(Las),、MotCa _(Las)和HlyCa _(Las)基因均成功构建至植物表达载体上。本生烟瞬时表达试验证实:当含有目的基因的根癌农杆菌菌悬液OD600值介于_(0.)6_(~0.)^(8,)测试本生烟苗龄6周左右,PalCa _(Las)基因在接种4 dpi时可引发明显的HR(hypersensitive reaction)反应,12 dpi时HR反应更为强烈。同等条件下MotCa _(Las)和HlyCa _(Las)均不能引发类似反应。由此证实,Gateway技术可成功用于筛选CaLas致病相关基因,PalCa _(Las)基因可能在CaLas致病过程中发挥重要作用。该报道为国内首次采用Gateway技术进行CaLas致病相关基因功能研究,为后续开展CaLas病原寄主互作分子机制研究奠定了基础。
钱艳杰刘敏刘敏王世玲洪霓洪霓王国平
关键词:黄龙病菌致病相关基因GATEWAY技术
基于Gateway技术的E.stiedai孢子化卵囊cDNA表达文库构建
2017年
为深入研究斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)的分子生物学特征,揭示其与宿主细胞的互作及免疫机理,以E.stiedai阿拉尔分离株的新鲜孢子化卵囊为材料,采用Gateway技术分别构建了E.stiedai孢子化卵囊cDNA原核和慢病毒表达文库,并测定了文库质量。分析表明,表达文库平均插入片段大小为1.5kb,重组率为100%,慢病毒表达文库和原核表达文库容量分别为3.5×106,3.9×106 CFU/mL,符合高质量文库的标准,可用于进一步开展相关基因的克隆及功能研究,为研究E.stiedai的入侵及免疫机制奠定基础。
赵爱云齐萌齐萌井波
关键词:斯氏艾美耳球虫GATEWAY技术孢子化卵囊CDNA表达文库
利用Gateway技术构建神经元特异性人apoE4(1-272)真核表达质粒及鉴定
2017年
目的构建神经元特异性人apoE4(1-272)片段的真核表达质粒,并转染小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a细胞)验证其表达,为后续利用该质粒构建转基因小鼠,并探讨其作用奠定实验基础。方法以同济医学院生物化学与分子生物学系实验室已有的人apoE4质粒为基础,利用Gateway技术设计引物,将人apoE4(1-272)片段克隆至pRP.EX3d载体上,并将神经元特异性启动子SYN1插入至人apoE4(1-272)片段之前,再借助IRES元件连接EGFP报告基因,构建pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP重组表达质粒;经脂质体转染法将上述质粒转染至N2a细胞,转染24h后,荧光显微镜观察转染效率,并采用Western blot检测apoE4(1-272)蛋白的表达水平。结果成功构建神经元特异性表达人apoE4(1-272)的真核表达质粒,经测序鉴定各核心元件序列均正确无误,与预期结果相一致,且经转染N2a细胞观察到新构建质粒可顺利表达,Western blot检测结果显示apoE表达及分子量均与预期一致。结论成功构建了神经元特异性人apoE4(1-272)片段的表达质粒,并初步鉴定了其表达功能,为后续开展相关研究奠定了实验基础。
李子希卢颖洁刘晓峰冯曾义陈娟
关键词:GATEWAY技术
利用靶拟态合成和Gateway技术构建水稻miR164c沉默突变体被引量:1
2016年
以水稻基因组DNA为模板,PCR扩增得到与miR399互补的Os MIM399后,改造成与miR164c互补的靶拟态序列Os MIM164c,经测序分析后连入p GWC载体,获得入门载体p GWC-Os MIM164c;利用Gateway技术,将入门载体p GWC-Os MIM164c经LR反应连接到植物表达载体GCS中,获得GCS-Os MIM164c表达载体,经农杆菌介导将该表达载体导入水稻品种Kasalath的愈伤组织中,组织培养后获得再生植株并进行目的基因的PCR鉴定,Real Time PCR方法检测阳性突变体植株中miR164c的表达量.研究结果表明,miR164c在突变体植株中的表达量显著低于野生型,说明miR164c沉默突变体构建成功.
吴多周艳宋傲群刘浏史筱靓姜孝成
关键词:GATEWAY技术水稻
Gateway技术构建人RhoD慢病毒表达载体及转染人黑素瘤A375细胞株被引量:1
2016年
目的构建人RhoD基因的慢病毒载体并进行慢病毒包装和鉴定,转染人黑素瘤细胞A375,使其过表达RhoD蛋白,为后续研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基础。方法Gateway技术构建携带增强型绿色荧光蛋白EGFP的RhoD慢病毒载体,经PCR及基因测序鉴定后,与辅助质粒pLV/helper-SL3,pLV/helper—SIA及pLV/helper—SL5混合采用脂质体法制备DNA-Lipofectamine2000复合物,并共同转染293FT细胞进行慢病毒包装,产生相应慢病毒颗粒,通过定量PCR方法测定病毒滴度。包装好的慢病毒转染人黑素瘤A375细胞,荧光显微镜下观察荧光表达情况,流式细胞仪检测转染效率;实验分为A375(未处理对照组)、A375-EGFP(不含目的基因的空病毒对照组)和A375-RhoD(含RhoD基因的病毒组)三组,采用实时荧光定量PCR(QPCR)及免疫印记法(western blotting,WB)验证耽扣在A375-RhoD组细胞中的过表达。结果通过PCR、基因测序证实,慢病毒表达载体pLV[Exp]-EGFP/Neo—CMV〉hRhoD构建成功。与辅助质粒共转染293FT细胞包装出具高效感染力的慢病毒,经测定病毒滴度为(5.13±2)×10^8TU/mL。转染A375细胞后可见明显的绿色荧光表达,流式检测转染效率大于80%;A375-RhoD组RhoDmRNA及蛋白水平均较A375-EGFP组和A375组细胞中明显增高。结论成功构建RhoD慢病毒表达载体,包装出具高效感染力的慢病毒颗粒并成功转染人黑素瘤A375细胞,为进一步研究RhoD在黑素瘤中的作用提供实验基础。
温斯健倪娜娜周晓伟吴琼王小坡宋昊张韡孙建方
关键词:慢病毒GATEWAY技术A375

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李光玉
作品数:144被引量:347H指数:10
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潘蕾
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研究主题:大豆花叶病毒 大豆 病毒抗性 农杆菌介导 GATEWAY技术