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牛源IFI6基因的克隆及其蛋白生物信息学分析与真核表达 载体 构建 2025年 构建 牛源IFI6基因真核表达 载体 ,试验采用RT-PCR方法扩增牛肾细胞(MDBK)的IFI6基因,对其蛋白的理化性质、蛋白亲/疏水性、信号肽、跨膜结构域、二/三级结构进行预测分析,并构建 牛源IFI6基因真核表达 载体 pEGFP-N1-IFI6。结果:牛源IFI6基因开放读码框序列长度为405 bp,编码134个氨基酸,蛋白分子质量为32425.61 u,等电点为5.20,不稳定系数为57.75(>40),属于不稳定疏水性蛋白质,存在信号肽和跨膜结构域;Eco RⅠ、Bam HⅠ双酶切的pEGFP-N1-IFI6重组质粒扩增出4700、405 bp条带,分别与pEGFP-N1、IFI6基因相符。结论:pEGFP-N1-IFI6真核表达 载体 构建 成功,可为家畜的抗病毒研究奠定基础。关键词：生物信息学分析 表达载体构建 马山黑山羊MAPK8基因克隆、生物信息学分析及真核表达 载体 构建 2025年 构建 其真核表达 载体 ,为山羊乳腺发育及MAPK8基因在转分化过程中的研究提供试验材料。[方法]参考山羊MAPK8基因序列(GenBank登录号:XM_018042429.1)设计引物,利用PCR扩增马山黑山羊MAPK8基因CDS序列并克隆;分别使用DNAStar和Mega 11.0软件进行序列比对及系统进化树构建 ,并利用ProtParam、ProtScale等软件进行生物信息学分析;构建 真核表达 载体 并进行慢病毒包装后收集病毒液上清,感染马山黑山羊成纤维细胞,并通过实时荧光定量PCR检测感染病毒组和对照组MAPK8基因表达 水平。[结果]马山黑山羊MAPK8基因CDS区全长1 155 bp,编码384个氨基酸,蛋白分子质量为43.98 ku,分子式为C_(1968)H_(3114)N_(528)O_(569)S_(22),等电点(pI)为7.13。相似性比对结果显示,马山黑山羊与不同物种间MAPK8基因氨基酸序列相似性均高于85%,表明MAPK8氨基酸序列较为保守。系统进化树显示,马山黑山羊MAPK8基因氨基酸序列与牛的亲缘关系最近,与斑马鱼的亲缘关系最远。马山黑山羊MAPK8蛋白为亲水性,不属于跨膜蛋白,主要分布在细胞质(52.2%)、线粒体(26.1%)、细胞核(17.4%)和细胞膜(4.3%)中,含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(第26―321位氨基酸处)。MAPK8蛋白二级结构包括无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链。互作蛋白预测显示,MAPK8蛋白可能与MAPK9、JUN、TP53、FOS、JUNB、MAP2K4、MAP2K7、MAPK8IP1和NFATC3蛋白存在互作。试验成功构建 MAPK8基因慢病毒真核表达 载体 pCDH-CMV-MAPK8-mchery-Puro,转染马山黑山羊成纤维细胞后产生红色荧光信号,试验组细胞内MAPK8基因表达 量极显著高于对照组(P<0.01)。[结论]本研究成功克隆了马山黑山羊MAPK8基因CDS序列,并构建 了pCDH-CMV-MAPK8-mchery-Puro真核表达 载体 ,为山羊MAPK8基因功能及应用�关键词：生物信息学 真核表达 鸡SOX6基因真核表达 载体 构建 及其对成肌细胞分化相关基因表达 的影响 2025年 表达 和在成肌细胞分化中的作用,采用荧光定量PCR方法检测鸡不同组织以及胚胎期(E11~E19)和出壳早期(D0、D3、D6)骨骼肌中SOX6 mRNA的表达 ;通过RT-PCR扩增并克隆鸡SOX6基因的编码序列区(CDS),经测序分析并利用生物信息学工具预测鸡SOX6蛋白的理化性质和结构功能;构建 鸡SOX6基因的真核表达 载体 并转染至鸡原代成肌细胞,Western blot技术检测重组蛋白的表达 ;利用荧光定量PCR检测过表达 和敲低SOX6基因对成肌分化相关基因表达 的影响。结果显示:SOX6 mRNA在鸡12种不同组织中均有表达 ,其中在胸肌、腿肌较高,而在肌胃和脾脏较低;SOX6 mRNA在胚胎期E11~E19表达 量逐渐增加,D6期显著高于其他时期(P<0.05);获得鸡SOX6基因编码区全长2 367 bp,共编码789个氨基酸;生物信息学分析鸡SOX6蛋白为中性、亲水性蛋白,分子量为87.533 kDa,等电点为6.99,不稳定系数为60.95,脂肪系数为62.51;构建 SOX6过表达 载体 并转染至鸡原代成肌细胞中,成功表达 出SOX6-MYC融合蛋白;在成肌细胞中过表达 SOX6后,肌肉分化标志基因生肌分化因子(MyoD)和肌细胞生成素(MyoG) mRNA表达 显著上升(P<0.05),而敲降SOX6后MyoD和MyoG mRNA表达 显著下降(P<0.05)。结果表明:SOX6基因对成肌细胞分化发育具有调控作用,为进一步分析SOX6基因功能奠定基础。关键词：克隆 真核表达 一种表达 重组水蛭素的藻类表达 载体 构建 方法 表达 载体 构建 方法及培养。本发明通过将内源性启动子beta2‑tubulin和RBCS2内含子序列组成关键启动元件，与Hygromycin抗性基因相链接，...木薯Ⅴ型几丁质酶MeCHITV基因生物信息学分析及其表达 载体 构建 2025年 表达 模式和遗传进化关系进行了全面分析。构建 了MeCHITV基因的原核表达 载体 、过表达 载体 和基因编辑载体 。【结果】MeCHITV基因的编码序列(CDS)全长1137 bp,编码378个氨基酸。MeCHITV蛋白的分子质量为42.09 ku,等电点为6.92,不稳定系数为33.97,是稳定蛋白且具有亲水性。其N端含有一个由21个氨基酸组成的信号肽序列。二级结构由33.33%的α螺旋、4.76%的β折叠、41.01%无规则卷曲和20.90%延伸链构成。与截形苜蓿Ⅴ型几丁质酶MtNFH1的同源性最高,亲缘关系最近。MeCHITV基因在木薯须根中表达 量最高。此外,成功构建 了原核表达 载体 pET28a-MeCHIV、过表达 载体 pCAMBIA1300-35S-MeCHITV和基因编辑载体 pYAO:hSpCas9-MeCHITV,并分别成功转化至原核表达 菌株Rossetta(DE3)和根癌农杆菌LBA4404。【结论】根据MeCHITV基因在须根中的高表达 及对其所编码蛋白的结构,推断MeCHITV在根际发挥功能。结合同源性蛋白功能的分析,推测MeCHITV参与了木薯与丛枝菌根真菌(AMF)共生信号的调控。关键词：木薯 丛枝菌根真菌 马铃薯StCHS4和StCHS5表达 载体 构建 及功能分析 2025年 表达 量分析,在马铃薯CHS家族中筛选到花青素生物合成关键基因StCHS4和StCHS5。为进一步探究马铃薯StCHS4和StCHS5在类黄酮和花青素生物合成中的功能,首先利用在线网站分析StCHS4和StCHS5蛋白结构,之后以pRI101双元表达 载体 为基础,通过同源重组法构建 35S∷StCHS4-GFP和35S∷StCHS5-GFP植物过表达 载体 ,并将重组载体 转化至农杆菌GV3101菌株中。利用本氏烟草进行瞬时转化,明确StCHS4和StCHS5蛋白亚细胞定位情况。以红花烟草为试验材料,分别进行瞬时超表达 和稳定遗传转化,分析StCHS4和StCHS5基因过表达 后总类黄酮和总花青素的含量变化。结果表明:StCHS4和StCHS5蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,StCHS4为不稳定的亲水蛋白,StCHS5为稳定的亲水蛋白。StCHS4和StCHS5分别与辣椒CHS和番茄CHS1亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示,StCHS4和StCHS5蛋白均在细胞质和细胞膜中表达 。烟草瞬时超表达 中,StCHS4和StCHS5基因在注射3~5 d显著促进花青素累积。分别获得3个阳性烟草转基因株系,与野生型相比,转基因植株中StCHS4和StCHS5显著高表达 ,总类黄酮和总花青素含量均高于野生型。StCHS4-OE3和StCHS5-OE1转基因植株中的总类黄酮含量显著提升,StCHS5-OE1和StCHS5-OE2中花青素含量分别提高89%,131%。上述结果表明,StCHS4和StCHS5是马铃薯类黄酮通路中关键CHS基因,过表达 可促进花青素与类黄酮生物合成。关键词：马铃薯 类黄酮 花青素 亚细胞定位 功能分析 桃PpCLH1基因过表达 载体 构建 与功能鉴定 2025年 表达 水平随着果实成熟褪绿呈现逐渐上升的趋势,在成熟前12 d达到最高,之后表达 量不断降低。瞬时过表达 PpCLH1基因后,烟草叶片颜色出现明显褪绿。PpCLH1是桃果皮转色期叶绿素降解的关键基因。【结论】通过对PpCLH1基因进行鉴定和功能研究,发现果实成熟前12 d PpCLH1明显高表达 ,在烟草叶片中瞬时过表达 PpCLH1会导致叶片明显褪绿,这为进一步解析桃果实发育过程中叶绿素降解的分子机制提供了参考。关键词：叶绿素酶 水牛SFRP 1基因序列分析、真核表达 载体 构建 及组织表达 分析 2024年 构建 SFRP 1基因真核表达 载体 ,检测SFRP 1基因在水牛不同组织中的表达 情况,为探索SFRP 1基因在水牛生长发育中的作用奠定基础。【方法】以水牛卵巢组织cDNA为模板,通过RT-PCR对SFRP 1基因CDS区序列进行扩增并测序,利用生物信息学在线分析软件对水牛SFRP 1基因与不同物种进行比对和系统进化树构建 ,并预测SFRP1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构等。将获得的目的基因连接至pCMV-HAhyPBase-mcheery载体 并转染至水牛颗粒细胞,检测转染后荧光和基因表达 情况。通过实时荧光定量PCR检测水牛不同组织中SFRP 1基因表达 情况。【结果】水牛SFRP 1基因CDS区长927 bp,共编码308个氨基酸。多重序列比对结果显示,水牛SFRP 1基因氨基酸序列与黄牛、牦牛、山羊、虎鲸、黑猩猩、北极狐、猫、人、小鼠的相似性分别为100%、100%、99.65%、98.58%、98.23%、98.23%、98.58%、98.23%、96.45%,存在CRD_FZ、NTR_like和DUF3367结构域。水牛SFRP 1基因核苷酸序列与黄牛、绵羊、山羊、牦牛、野牛、马鹿、野骆驼、猪、人的相似性分别为97.3%、95.9%、95.8%、94.5%、94.2%、93.7%、80.4%、78.5%和77.3%。系统进化树结果显示,水牛与黄牛、牦牛、野牛聚为一支。生物信息学分析结果显示,SFRP1蛋白呈碱性,为不稳定蛋白;第1—15位氨基酸处存在信号肽,为分泌型蛋白,存在跨膜结构,主要定位于细胞外;存在21个磷酸化位点和8个O-糖基化修饰位点。二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲构成;水牛、黄牛、人的SFRP1蛋白三级结构高度相似。成功构建 pCMV-mcheery-SFRP1真核表达 载体 并转染水牛颗粒细胞,转染72 h后pCMV-mcheery-SFRP1重组质粒组细胞内SFRP 1基因表达 量极显著高于对照组(P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,SFRP 1基因在水牛不同组织中�关键词：水牛 真核表达载体 猪源hnRNPA1基因克隆及其真核表达 载体 构建 2024年 构建 其真核表达 载体 ,为探究猪源hnRNPA1蛋白结构及其生物学特性提供理论参考。【方法】利用总RNA提取试剂盒提取PK-15细胞总RNA并反转录合成cDNA,以此为模板,采用SnapeGene设计hnRNPA1基因特异性扩增引物,PCR扩增获得hnRNPA1基因CDS序列。通过ProtParam、ExPASy-ProtScale、TMHMM-1.0、SignalP-6.0、SPOMA、SWISS-MODEL和NetPhos 3.1等预测hnRNPA1蛋白的理化性质、结构及磷酸化位点。构建 pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达 载体 并转染HEK-293T细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blottiing和免疫荧光染色试验检测hnRNPA1基因真核表达 载体 构建 情况、hnRNPA1蛋白在细胞中的表达 及分布情况。【结果】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。生物信息学分析结果显示,hnRNPA1基因CDS序列全长963 bp,编码320个氨基酸残基,hnRNPA1蛋白分子量约为35 kD,理论等电点(pI)为9.27,脂肪系数为38.34,不稳定系数为43.87(大于40.00),蛋白结构相对不稳定,总平均亲水性指数(GRAVY)为-0.879,属于亲水性蛋白,不含跨膜结构域和信号肽,二级结构由α-螺旋(16.56%)、无规则卷曲(72.50%)和延伸链(10.94%)组成,存在48个潜在的磷酸化位点。Western blotting检测结果显示,真核表达 载体 pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag转染HEK-293T细胞后能成功表达 hnRNPA1蛋白。免疫荧光染色结果显示,hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达 。【结论】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。猪源hnRNPA1蛋白为不稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域和信号肽,二级结构主要为无规则卷曲。成功构建 pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达 载体 ,hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达 。关键词：生物信息学分析 表达载体构建 鼠源ATP5B基因克隆及其原核和真核表达 载体 构建 2024年 构建 其原核和真核表达 载体 ,为研究ATP5B蛋白功能及其在病毒感染过程中的作用机制提供基础。【方法】克隆鼠源ATP5B基因编码区(CDS),运用ProtParam、ProtScale和SignalP-5.0等对ATP5B蛋白进行生物信息学分析。采用同源重组方法构建 原核表达 载体 pGEX-4T-1-ATP5B-Flag和真核表达 载体 pcDNA3.0-ATP5B-Flag。以原核表达 载体 pGEX-4T-1-ATP5B-Flag转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达 ,分析最适诱导温度和IPTG浓度。以真核表达 载体 pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测ATP5B蛋白在细胞中的表达 及分布情况。【结果】鼠源ATP5B基因CDS长1590 bp,鼠源ATP5B蛋白由529个氨基酸残基构成,分子量为55 kD,理论等电点(pI)为5.21,属于稳定的疏水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,不属于分泌蛋白;鼠源ATP5B蛋白二级结构中α-螺旋占43.67%,无规则卷曲占32.51%,β-转角占9.45%,延伸链占14.37%。原核表达 载体 pGEX-4T-1-ATP5B-Flag经IPTG诱导后,通过考马斯亮蓝染色和Western blotting在81 kD处成功检测到融合蛋白,且主要以包涵体形式表达 ,诱导条件以30℃、0.5 mmol/L IPTG的效果更好。以真核表达 载体 pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞后,在55 kD处检测到Flag标签特异性条带,即ATP5B蛋白在HEK-293T细胞中成功表达 ,IFA检测结果表明该蛋白主要定位在细胞质中。【结论】成功构建 鼠源ATP5B基因原核和真核表达 载体 ,原核表达 载体 表达 出的融合蛋白主要以包涵体形式存在,只有少量可溶蛋白,真核表达 的ATP5B蛋白主要定位在细胞质中。鼠源ATP5B蛋白是理化性质稳定的疏水性蛋白,无信号肽位点,不属于分泌蛋白。关键词：基因克隆 生物信息学分析 表达载体构建
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