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云南省库蠓源蓝舌病病毒16型的分离鉴定: 2025年; 为了解云南省部分地区库蠓源蓝舌病病毒(BTV)流行情况,本试验于2023年7—10月分别从云南省昆明市宜良县和保山市龙陵县采集昆虫样品进行种属鉴定和虫媒病毒分离鉴定。基于昆虫的线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列进行BLAST序列比对和种属鉴定。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测、病毒分离培养、间接免疫荧光试验和病毒毒价测定对所获得的虫媒病毒进行分离和鉴定,以及遗传进化分析。结果显示,采集的昆虫样品分别属于尖音库蚊、隐匿库蠓、拜氏铗蠓和蠓科。其中,采自云南省保山市龙陵县的样品RT-PCR检测结果为BTV阳性,经BHK-21细胞连续传代培养,得到1株BTV分离株;间接免疫荧光试验结果显示,分离株能与BTV-16标准阳性血清发生特异性反应,初步确定该分离株为BTV-16,将其命名为YNLL-BTV16-2023,其毒价为10-5.1/0.1 mL。遗传进化分析结果显示,分离株VP2基因序列与2株日本分离株基因序列(GenBank登录号:LC586239.1和AB686220.1)核苷酸同源性最高,分别为97.20%和96.87%,VP3基因序列与中国云南省分离株VP3基因序列(GenBank登录号:MG564322.1)核苷酸同源性为99.26%,VP5基因序列与日本分离株(GenBank登录号:AB686236.1)核苷酸同源性为97.77%,VP7基因序列与2株中国分离株(GenBank登录号:AF172831.1和KT002584.1)核苷酸同源性均为98.80%。结果表明,云南省保山市龙陵县边境地区存在BTV-16毒株,该血清型病毒可通过隐匿库蠓携带。本试验为云南省边境地区BTV及其传播媒介的分布提供参考。; 付嘉佳李富祥王金萍何于雯谢佳芮高华峰李小兵; 关键词：遗传进化分析

蓝舌病病毒抗宿主干扰素免疫应答机制研究进展: 2024年; 蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)常通过媒介昆虫库蠓叮咬感染绵羊、牛、鹿等,引起家养及野生反刍动物蓝舌病(bluetongue,BT)。目前BT在全球亚热带甚至温带地区广泛分布,严重威胁世界畜牧业发展及国际贸易。本文介绍了BTV结构及其细胞侵入过程,并对宿主细胞抗BTV免疫应答以及BTV非结构蛋白NS3、NS4和结构蛋白VP3、VP4等拮抗宿主细胞天然免疫应答机制进行综述,为深入了解BTV拮抗宿主细胞干扰素(interferon,IFN)免疫应答的分子机制及研究BTV致病机制和新型疫苗提供了参考。; 李其沙蔡旭研罗世美陈韵伊易华山马鲜平; 关键词：蓝舌病病毒非结构蛋白抗病毒免疫

荧光素酶免疫吸附法高灵敏检测蓝舌病病毒抗体方法的建立: 2024年; 为了建立一种高效检测动物血清中蓝舌病病毒(BTV)抗体的检测方法,以BTV血清群特异性VP7抗原与荧光素酶蛋白相融合表达的标记蛋白(VP7-NLuc)为检测抗原建立了荧光素酶免疫吸附(VP7-NLuc-LISA)方法,用于检测BTV抗体。结果表明:BTV阳性血清能特异性识别VP7-NLuc融合蛋白;监测BTV-1灭活疫苗免疫绵羊血清中BTV抗体动态结果表明,VP7-NLucLISA方法与商品化竞争性ELISA(c-ELISA)试剂盒的检测结果呈高度相关性(R=0.76,P<0.001);对264份田间血清样本的调查结果表明,建立的VP7-NLuc LISA方法与商品化c-ELISA试剂盒的符合率为98.86%,其相对特异性为99.52%,相对敏感性为96.49%。结论:所建立的VP7-NLuc-LISA方法可作为大规模动物BTV流行病学调查和监测的新方法。; 张鸿歌田占成独军政王琼洁康棣户鑫兵张忠辉关贵全殷宏; 关键词：蓝舌病病毒 VP7蛋白 C-ELISA

蓝舌病病毒感染对BHK-21细胞中Ⅰ型干扰素应答的影响: 2024年; 蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)是一种严重危害绵羊等反刍动物的一种虫媒病毒,为研究蓝舌病病毒感染与宿主细胞干扰素抗病毒免疫应答的分子机制。研究以感染复数(MOI)为1的BTV诱导18、24、36 h的BHK-21细胞通过实时荧光定量PCR分析干扰素通路基因mRNA表达特征,以及Western blot分析MDA5、TRAF3、RIG-Ⅰ和TBK1蛋白表达。结果表明,在诱导24 h时,干扰素信号通路基因表达的变化最为明显,IFN-α、IFN-β、RIG-Ⅰ、TBK1、MDA5、VISA、TRAF3基因的mRNA表达水平呈上调表达,而IKKε、TRAF6基因的mRNA表达水平呈下调表达,在蛋白水平上MDA5、TBK1蛋白上调表达而RIG-Ⅰ、TRAF3蛋白下调表达,表明BTV感染诱导BHK-21细胞中Ⅰ型干扰素免疫应答,为进一步探究IFN-Ⅰ信号通路调控基因在BTV感染的宿主细胞抗病毒免疫机制研究奠定基础。; 罗世美陈韵伊李其沙周艳梅王怡斐廖芯玉胡雪柔魏远健李梦琴朱萌张迅陈贝蕊马鲜平谢佳芮寇美玲苗海生李芳易华山; 关键词：蓝舌病病毒天然免疫 BHK-21

蓝舌病病毒VP7抗原在重组杆状病毒表达系统中的表达与鉴定: 2024年; 本试验通过在重组杆状病毒表达系统中制备、纯化与鉴定蓝舌病病毒VP7抗原,为开发蓝舌病病毒免疫学抗体检测方法提供科学依据。利用SignalP与TMHMM在线软件分析VP7序列的信号肽与跨膜疏水区序列,对选择的目的基因片段进行稀有密码子优化,将化学合成后的核苷酸序列连接至pFastBacHTA载体上,并构建相应的重组杆粒Bacmid-VP7-DH10Bac,转染sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒Bacmid-BTV-VP7株,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达制备蓝舌病病毒VP7抗原。结果显示,重组杆粒Bacmid-VP7-DH10Bac转染sf9昆虫细胞并连续盲传5代后,成功获得重组杆状病毒Bacmid-BTV-VP7株,并成功表达纯化出VP7蛋白,大小约为43 kDa,蛋白纯度约为94%;VP7重组蛋白与其他疫病抗体无非特异性交叉。综上,重组VP7蛋白能够与BTV阳性血清呈现特异性反应,具有良好的反应原性,蛋白纯度高,并且具有病毒蛋白的生物学活性,将其作为诊断抗原,后期可用于开发系列免疫学抗体诊断检测技术。; 王乃福刘志玲吴冬雪孙雨孙航宋晓晖宋晓晖; 关键词：蓝舌病杆状病毒蛋白鉴定

免疫共沉淀联合质谱技术筛选蓝舌病病毒NS4蛋白的互作蛋白: 2024年; [目的]筛选蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)NS4蛋白颉颃干扰素(interferon, IFN)信号通路的内源性互作蛋白,以便进一步研究NS4抑制IFN信号转导的作用机制。[方法]在前期仙台病毒(Sendai virus, SeV)诱导IFN信号通路基因表达研究基础上,利用免疫共沉淀方法从转染NS4融合eGFP标签表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP和pcDNA3.1-eGFP空载体的HEK-293T细胞中钓取NS4互作蛋白,对免疫沉淀物进行SDS-PAGE分析,免疫共沉淀洗脱液进行质谱鉴定及生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白的编码基因表达特征。[结果]通过免疫共沉淀及质谱鉴定分析和数据库比对,共获得189个差异表达蛋白。生物信息学分析结果显示,候选蛋白主要参与蛋白转录、翻译、病毒感染及免疫调控。亚细胞定位分析结果显示,差异表达蛋白主要定位于细胞核、细胞质以及胞质-胞核,筛选出4个与BTV NS4蛋白存在互作的候选蛋白:多聚嘧啶束结合蛋白1(PTBP1)、细胞周期依赖性蛋白激酶9(CDK9)、N-端豆蔻酰化酶1(NMT1)和Y盒结合蛋白1(YBX1)。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,SeV刺激72 h后,试验组PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9基因mRNA表达量均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01)。[结论]BTV NS4蛋白颉颃IFN信号通路与PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9蛋白表达上调有关,本试验结果为进一步研究BTV NS4蛋白颉颃宿主天然免疫应答的分子机制提供靶标参考。; 马鲜平陈玉娟罗世美卓晓静杨义彬刘祎毅蔡旭研唐艺匀陈畅昶魏小蓉易华山; 关键词：免疫共沉淀质谱分析

蓝舌病病毒感染对绵羊微血管内皮细胞中Ⅰ型干扰素应答的影响: 2024年; 蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)是一种严重危害绵羊等反刍动物的虫媒病毒,而绵羊微血管内皮细胞(sheep lung microvascular endothelial cells,SLMECs)构成肺半选择性屏障,为研究BTV感染与SLMECs干扰素抗病毒免疫应答的分子机制。本研究通过BTV噬斑试验以感染复数(MOI)为1的BTV诱导18、24、36 h的SLMECs,通过实时荧光定量PCR分析干扰素相关通路基因mRNA表达特征,以及Western blot分析MDA5、TRAF3、RIG-I和TBK1蛋白表达。结果表明,在诱导36 h时,干扰素信号通路基因mRNA表达的变化最明显,RIG-I、MDA5、IKKε、IFN-β、TBK 1和TRAF 6基因mRNA上调表达,差异极显著;而IFN-α、VISA、USP 18基因mRNA下调表达,差异极显著;在蛋白水平上MDA5、TBK1、RIG-I和TRAF3蛋白都上调表达。本研究发现BTV可感染SLMECs诱导Ⅰ型干扰素免疫应答,为进一步分析IFN-I信号通路的激活在抗BTV感染天然免疫应答中的作用机制研究奠定基础。; 罗世美陈韵伊李其沙周艳梅胡雪柔李铭悦魏子昱李芳马鲜平易华山; 关键词：蓝舌病病毒

一种基于CRISPR-Cas13a的蓝舌病病毒特异性crRNA及其相关试剂盒与检测方法: 本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas13a的蓝舌病病毒特异性crRNA及其相关试剂盒与检测方法，属于病毒检测技术领域。为解决现有的BTV检测方法耗时长、操作繁杂、无法实现现场实时检测等技术问题，本发明通过序列比对和筛选...; 齐瑛琳夏长友尹鑫高彩霞

干扰素刺激基因IFIT1抑制蓝舌病病毒的复制被引量：2: 2023年; 为了研究干扰素刺激基因1(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1,IFIT1)在蓝舌病病毒1型(Bluetongue virus serotype 1,BTV1)感染复制过程中的作用,首先利用实时定量PCR检测到BTV1感染绵羊睾丸细胞后IFIT1基因的转录水平明显升高,利用RT-PCR方法扩增获得羊IFIT1基因,测序后进行生物信息学分析,将其克隆到质粒载体pcDNA3.1/(+)上,构建重组表达质粒pcDNA3.1-OV-IFIT1,将其转染BHK-21细胞,观察到IFIT1基因在细胞内的成功表达,然后利用BTV1感染质粒pcDNA3.1-OV-IFIT1转染的细胞,从病毒的mRNA转录、蛋白表达和病毒滴度的变化评价IFIT1对BTV1复制的影响。结果显示,IFIT1在细胞中的过表达可显著抑制BTV1复制,相反,敲低IFIT1的表达可促进BTV1的复制。本研究首次报道了干扰素刺激基因IFIT1在BTV1感染复制过程中的作用,这将有助于揭示BTV1和宿主细胞IFIT1的相互作用机制,同时也为抗病毒药物研发提供了理论指导。; 张国芮康棣王轩莹田占成高闪电关贵全常惠芸薛慧文殷宏独军政; 关键词：IFIT1 蓝舌病病毒病毒复制抗病毒免疫

蓝舌病病毒NS4蛋白原核表达及多克隆抗体制备被引量：5: 2023年; 【目的】制备蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)NS4蛋白多克隆抗体,为BTV NS 4基因在病毒增殖及颉颃宿主细胞天然免疫应答中的作用研究奠定基础。【方法】构建pCzn1-NS4原核表达载体,经PCR和测序鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达,使用His标签镍柱纯化NS4蛋白,并经SDS-PAGE、Western blotting鉴定。利用NS4蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经SDS-PAGE和间接ELISA法测定多克隆抗体纯度及效价,以制备的NS4蛋白多克隆抗体为一抗,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测BTV感染的BHK-21细胞内NS4蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达质粒pCzn1-NS4,在37℃、IPTG浓度为0.6 mmol/L时诱导8 h获得大量NS4重组蛋白,SDS-PAGE及Western blotting试验结果显示,重组蛋白分子质量约为18 ku,可与兔His-tag抗体发生特异性反应;制备的NS4蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上。经SDS-PAGE和IFA鉴定,制备的BTV NS4多克隆抗体具有良好的纯度,且在BTV感染的BHK-21细胞中能特异性识别病毒表达的NS4蛋白。【结论】本研究利用原核表达的NS4蛋白制备了特异性多克隆抗体,并初步将该多克隆抗体用于NS4蛋白免疫荧光试验研究,为BTV NS 4基因的功能和应用研究提供参考依据。; 罗世美赵瑶马鲜平张金阳易华山; 关键词：原核表达多克隆抗体

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