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短发卡状RNA抑制AKT2对肝癌细胞增殖及侵袭的影响被引量：1: 2012年; 目的探讨短发卡状RNA（siRNA）抑制AKT2对肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移的影响。方法设计并合成特异性靶向AKT2的siRNA片段并构建sMMc7721AKT2-siRNA表达质粒，将其转染SMMC7721细胞，通过G418筛选出稳定株。MTT法检测肝癌SMMC7721细胞的生存率变化；流式细胞术检测细胞周期；Western-blot检测P27、CyclinD1；Transwell实验和划痕实验分析细胞侵袭、转移能力的改变。结果MTT检测显示AKT2干扰可抑制sMMc7721细胞的生长，与其他组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。流式细胞术显示AKT2干扰组细胞周期阻滞于G1期，G1期细胞比例上升，s期细胞比例下降。Western-blot检测显示CyclinD1表达下降，P27的表达上升。Transwell试验和划痕试验显示AKT2干扰组的侵袭和转移能力受到抑制。结论AKT2基因沉默可明显抑制肝癌SMMC7721细胞的生长并阻滞细胞周期。AKT2基因沉默可抑制肝癌SMMC7721细胞的侵袭和转移能力。; 谢毅王旺河张超李国庆田鹏张辉王志凯梁鸿钱海鑫; 关键词：肝癌细胞 AKT2 RNA干扰

靶向人肝素酶短发卡状RNA表达载体的构建及其沉默作用: 2010年; 目的构建靶向人肝素酶（HPSE）的短发卡状RNA（shRNA）表达载体，探讨其基因沉默作用。方法根据人肝素酶mRNA序列设计shRNA，合成两条互补的寡核苷酸链，退火后连接人pGenesil-1载体，转化扩增后进行测序鉴定；重组质粒在阳离子脂质体Lipofectamine2000的介导下，瞬时转染人胃癌细胞株SGC-7901、人前列腺癌细胞株PC-3、人膀胱癌细胞株EJ，每种细胞分别设空白对照组、空载体pGenesil-Negative转染组、pGenesil-HPSEshRNA转染组3组，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Westernblot法检测各种细胞中肝素酶基因表达水平，黏附实验和transwell小室实验检测癌细胞游走、侵袭能力。结果所构建的shRNA载体插入基因片段与设计序列完全匹配，载体构建成功；重组质粒转染SGC-7901、PC-3、EJ细胞后，肝素酶mRNA表达分别下调78．6％（P〈0．01）、82．6％（P〈0．01）、81．9％（P〈0．01），肝素酶蛋白表达分别下调76．4％（P〈0．01）、85．9％（P〈0．01）、83．3％（P〈0．01），细胞黏附能力分别下降37．7％（P〈0．01）、44．6％（P〈0．01）、43．8％（P〈0．01），细胞侵袭能力分别下降66．8％（P〈0．01）、76．6％（P〈0．01）、80．5％（P〈0．01）。结论成功构建了靶向人肝素酶的shRNA表达载体，沉默肝素酶基因表达后，能抑制多种癌细胞的游走和侵袭能力。; 蒋国松曾甫清郑丽端童强松董继华侯晓华; 关键词：肝素酶短发卡状RNA 肿瘤基因表达

短发卡状RNA抑制AKT2基因治疗肝癌的实验研究: 原发性肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤，约占消化系统肿瘤的20％以上，其中肝细胞肝癌约占90％，其生物学特征为易复发、转移、预后差、死亡率高。尽管目前原发性肝癌的治疗方案（手术切除、介入治疗、生物治疗、激光及微波治疗等）日趋...; 谢毅; 关键词：蛋白激酶B 小干扰RNA 基因治疗肝癌

短发卡状RNA抑制人Bub1基因表达及其对人卵巢癌A2780细胞药物敏感性和周期的影响被引量：2: 2010年; 背景与目的:既往研究提示,紫杉醇类药物作用的发挥有赖于功能完整的纺锤体检查点,而Bub1是纺锤体检查点的重要组成部分。本研究旨在探讨Bub1短发卡状RNA真核表达载体稳定转染对人卵巢癌A2780细胞紫杉醇敏感性及细胞周期的影响。方法:构建Bub1基因短发卡状RNA真核表达载体pEGFP-Bub1-shRNA,以脂质体LipofectamineTM2000包裹空质粒转染体外培养的人卵巢癌细胞株A2780后进行稳定筛选。应用RT-PCR、Western印迹法分析目的基因mRNA及其蛋白水平的表达情况;MTT法、流式细胞术等方法检测转染前后,A2780细胞对紫杉醇敏感性及其细胞周期的变化;Hoechst33342染色法检测细胞分裂指数。结果:与对照组pEGFP-C1/A2780及A2780组相比,pEGFP-Bub1-ShRNA/A2780组细胞中mRNA和蛋白水平的表达均明显下降,其差异具有统计学意义(P<0.05);MTT检测结果提示,转染pEGFP-Bub1-shRNA质粒后细胞对紫杉醇的敏感性明显降低,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,紫杉醇1μmol/L处理细胞24及48h后,与pEGFP-C1/A2780及A2780组相比,该组细胞凋亡率明显降低(P<0.05),G2/M期细胞比例下降,差异具有统计学意义(P<0.05);Hoechst33342染色提示,与对照组相比,pEGFP-Bub1-shRNA/A2780组的分裂指数(MI)明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:Bub1基因的下调可导致人卵巢癌A2780细胞对紫杉醇敏感性及G2/M期细胞比例下降。pEGFP-C1-shBub1质粒的成功构建,为研究Bub1基因的功能及定位的研究提供了进一步的实验条件。; 周婷翁丹卉王世宣卢运萍马丁; 关键词：卵巢癌紫杉醇

三位点短发卡状RNA在提高RNA干扰效率中的作用被引量：6: 2008年; 背景与目的:shRNA技术是近来发展的热点技术之一,但普遍采用的单位点shRNA干扰载体效果并不理想。本研究探讨三位点短发卡状RNA在提高RNA干扰效率中的作用。方法:构建外源基因DsRed全长载体转染HEK293细胞。针对报告基因DsRed设计4个干扰载体,一个含有3段shRNA,另外3个分别含有此3段中1段shRNA。转染293/DsRed,荧光显微镜观察基因DsRed。应用实时定量PCR(Real-timePCR)和流式细胞仪(FACS)检测4个载体对DsRed基因在mRNA及蛋白水平干扰效应。结果:4个载体对靶基因DsRed在mRNA及蛋白水平均有干扰效应,且含有3段shRNA载体对DsRed基因干扰效率为(89±16)%,显著高于3个只含有1段shRNA载体[(50±23)%,(52±15)%,(55±27)%],差异有显著性(P<0.05)。结论:三位点shRNA干扰载体可以提高对靶基因的干扰效率。; 翁艳洁翁丹卉夏曦宋晓红卢运萍王世宣马丁王常玉; 关键词：RNA干扰外源基因 DSRED 短发卡状RNA

大鼠Pik3cb短发卡状RNA对平滑肌细胞增殖的影响被引量：3: 2008年; 目的:构建大鼠Pik3cb短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,为利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术从转录后水平抑制血管移植术后移植静脉再狭窄的研究做准备。方法:经预实验设计并合成6条shRNA寡核苷酸片段,酶切鉴定和测序正确后挑选2条质粒转染入大鼠胸主动脉平滑肌细胞内,48、72h用荧光显微镜观察转染效率,Western blot检测Phospho-Akt(Ser473)蛋白的表达,流式细胞仪分别在24、48、72、96h检测细胞凋亡数目。结果:构建的两条大鼠Pik3cbshRNA经限制性内切酶酶切和DNA测序正确后分别命名为pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2,转染平滑肌细胞48h和72h转染率分别为15.7%和10.1%;Westernblot结果显示转染组Phospho-Akt(Ser473)蛋白表达明显下降;流式结果表明pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2组凋亡细胞数目明显增加,与对照组相比有统计学意义(P<0.05),各时间点错配质粒组与正常对照组相比差异无统计学意义。结论:成功构建了2条大鼠Pik3cbshRNA真核表达载体,有效促进凋亡,抑制平滑肌细胞增殖,为靶向Pik3cb的RNAi防治血管再狭窄奠定了基础。; 刘苏健刘宏赵京申庆民常程邓勇志马捷; 关键词：SHRNA 血管再狭窄 RNAI

短发卡状RNA特异性抑制表皮生长因子受体对大肠癌细胞凋亡的影响: 2007年; 目的体外构建编码人类表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞EGFR的特异性抑制作用以及对细胞凋亡的影响。方法体外合成EGFR的DNA模板引物和Pgenesil-1质粒构建编码shRNA的表达载体。应用脂质体Lipofectamine2000转染人结肠癌LoVo细胞,转染成功后以G418筛选4周,实时荧光定量RT-PCR(realtime RT-PCR)和Western-blot检测EGFR的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果成功的构建了针对EGFR的质粒表达载体。质粒载体成功转染后,EGFR mRNA表达下降了(81.3±2.8)%,蛋白表达下降了(73.4±2.3)%,细胞凋亡增加了(10.1±0.4)%,和对照质粒载体比较差异有统计学意义。结论我们构建的针对EGFR的质粒表达载体可以显著抑制其在人结肠癌LoVo细胞的表达,诱导细胞凋亡,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。; 顾昱吴相柏李拥军尹宜发李欣邹立勇; 关键词：短发卡状RNA RNA干扰表皮生长因子受体结肠癌

质粒介导的短发卡状RNA特异性抑制大肠癌cerb-B1基因的表达被引量：2: 2007年; 目的:体外构建编码人类基因cerb-B1短发卡状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞cerb-B1基因和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白的特异性抑制作用。方法:体外合成cerb-B1基因的DNA模板引物,和Pgenesil-1质粒构建编码shRNA的表达载体。应用脂质体Lipofectamine2000转染人结肠癌LoVo细胞,转染成功后以G418筛选4周,实时荧光定量RT-PCR(RealTimeRT-PCR)检测cerb-B1基因的mRNA表达,Western-blot检测EGFR蛋白的表达。结果:质粒载体经酶切鉴定证实DNA模板插入质粒成功,且测序与设计结果相符,成功的构建了针对原癌基因cerb-B1的质粒表达载体。质粒载体成功转染后,cerb-B1基因mRNA表达下降了(81.3±2.8)%,EGFR蛋白表达下降了(73.4±2.3)%,和对照质粒载体组比较有显著性差异。结论:说明本研究构建的针对cerb-B1基因的质粒表达载体可以显著抑制cerb-B1基因和EGFR蛋白在人结肠癌LoVo细胞的表达,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。; 吴相柏邬跃刚宋文军曹政吴利达陶凯雄; 关键词：短发卡状RNA RNA干扰表皮生长因子受体

短发卡状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的研究被引量：4: 2007年; 目的:构建AKT2基因特异性短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,观察RNA干扰(RNAi)技术,对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞中AKT2蛋白激酶表达的抑制作用,并探讨其促进细胞凋亡的机制。方法:运用基因工程技术,设计合成针对AKT2 mRNA的特异性shRNA,构建真核表达载体pAKT2-shRNA。将pAKT2-shRNA经脂质体(LipofectamineTM2000)包裹转染人卵巢癌A2780和SKOV3细胞,荧光显微镜观察细胞内DsRed红色荧光蛋白的表达,计算转染效率,半定量RT-PCR(Semi-quantitativeRT-PCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot)检测AKT2的表达及干扰效率,流式细胞学检测法(FACS)检测细胞凋亡率,比较抑制AKT2基因前后卵巢癌细胞抵抗凋亡能力。结果:成功构建了pAKT2-shRNA载体。A2780和SKOV3细胞转染pAKT2-shRNA后,荧光显微镜下观察转染效率约40%;Semi-quantitativeRT-PCR和Western blot检测结果示,转染后AKT2 mRNA和蛋白表达均显著降低。FACS检测结果显示,转染pAKT2-shR-NA后,紫杉醇25nmol/L处理细胞12h,与空白对照组和阴性对照组相比,细胞凋亡率显著增加,P<0.05。结论:构建的pAKT2-shRNA真核表达载体能有效抑制AKT2基因表达;运用RNAi技术,降低卵巢癌细胞中AKT2基因表达水平,能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,促进肿瘤细胞凋亡。; 翁丹卉邢辉邓友星梁逢奇黄磊李芳马丁卢运萍; 关键词：卵巢肿瘤 RNA干扰

两位点短发卡状RNA诱导AKT2基因沉默在卵巢癌细胞紫杉醇敏感性中的应用研究被引量：9: 2007年; 目的:探讨AKT2基因在肿瘤细胞对紫杉醇敏感性中的作用。方法:分别构建2个针对同一AKT2基因不同位点的短发卡状RNA(shRNA)载体,转染人卵巢癌细胞A2780、SKOV3,荧光显微镜观察细胞内荧光蛋白的表达及转染效率,运用RT-PCR、蛋白质免疫印迹(western blotting)方法比较单独转染的抑制瘤和共转染对AKT2表达的沉默效率;抑制AKT2表达后,流式细胞仪(FACS)检测肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性。结果:构建的2种shRNA表达载体均可抑制AKT2 mRNA和蛋白的表达,共转染的抑制率明显高于分别单独转染的抑制率(P<0.05);FACS结果显示,共转染沉默AKT2基因后,细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论:共转染针对AKT2基因不同位点的2个shRNA真核表达载体,对AKT2基因的抑制效率高于单独转染1个载体;抑制卵巢癌细胞中AKT2基因表达,能增强其对紫杉醇的敏感性。; 宋晓红邢辉翁丹卉马晓黎卢运萍周剑锋马丁; 关键词：RNA干扰紫杉醇基因 AKT2

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